考虑光学显微镜的分辨率时，大部分重点放在垂直于光轴的平面中的点对点横向分辨率（图1）。分辨率的另一个重要方面是物镜的轴向（或纵向）分辨能力，该能力是平行于光轴测量的，通常被称为景深。
图1-景深范围
像水平分辨率一样，轴向分辨率仅由物镜的数值孔径决定（图2），目镜仅放大分解并投影到中间像平面的细节。就像在经典摄影中一样，景深取决于从近对焦的物体平面到远的平面（也同时对焦）的距离。在显微镜下，景深非常短，通常以微米为单位进行测量。术语“景深”指的是图像空间，通常可以与“景深”（指的是物体空间）互换使用。
术语的这种互换会导致混淆，尤其是当这两个术语都专门用于表示显微镜物镜中的景深时。可以预期几何像平面代表样品的无限薄部分，但是即使在没有像差的情况下，每个像点也会散布成在该平面上方和下方延伸的衍射图。艾里斑片是显微镜物镜产生的衍射图的基本单位，代表通过中间像平面中心的截面。这会增加通过稍微不同的样本平面的z轴艾里斑强度分布的有效聚焦深度。
表1-景深和影像深度放大数值孔径景深（um）图像深度（mm）
4倍0.10 55.5 0.13
10倍0.25 8.5 0.80
20倍0.40 5.8 3.8
40倍0.65 1.0 12.8
60倍0.85 0.40 29.8
100倍0.95 0.19 80.0
聚焦深度随数值孔径和物镜的放大倍数而变化，并且在某些情况下，即使景深较小，高数值孔径系统（通常具有较高的放大倍数）也比低数值孔径的系统具有更高的聚焦深度。 （请参阅表1）。这在显微摄影中尤为重要，因为胶片乳剂或数码相机传感器必须在落在聚焦区域内的平面上曝光或照明。聚焦于高放大倍率的小误差并不像具有非常低的放大倍率的物镜那样关键。表格1 提出了在一系列物镜中，随着数值孔径和放大倍数的增加，计算出的景深和中间图像平面中图像深度的变化。
在显微镜的高数值孔径下，景深主要由波光学器件确定，而在较低数值孔径下，几何光学混乱圈占主导地位。使用多种不同的标准来确定图像何时变得不可接受的清晰，几位作者提出了不同的公式来描述显微镜中的景深。总的景深由波和场的几何光学深度之和得出：
其中d（tot）代表景深，λ是照明光的波长，n是盖玻片和物镜前透镜之间的介质（通常是空气（1.000）或浸油（1.515））的折射率，和na等于物镜的数值孔径。可变Ë是可以由被放置在显微镜物镜，其横向放大率是的图像平面中的检测器来解决的小距离中号。使用此公式，景深（d（tot））和波长（λ）必须以相似的单位表示。例如，如果要以微米计算d（tot），λ也必须以微米为单位（等式中以700微米输入700纳米的红光）。请注意，衍射极限景深（方程式中的项）与数值孔径的平方成反比，而分辨率的横向极限则以与数值孔径的一阶成反比的方式减小。因此，系统数值孔径对可获得的光学部分的轴向分辨率和厚度的影响远大于显微镜的横向分辨率。
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人眼通常可容纳无限远至约25厘米，因此，当人们通过目镜观察显微镜图像时，景深可以大大大于以上等式给出的景深。另一方面，视频传感器或照相乳剂位于固定的薄平面上，因此，这些传感器的景深和轴向分辨率由方程中的参数给出。在这些情况下，轴向分辨率通常定义为沿着物镜产生的三维衍射图像的轴，在焦点上方和下方的小值之间的距离的四分之一。
图2-景深与数值孔径的关系
对于聚光镜的数值孔径大于或等于物镜的数值孔径的非相干照明（或发射）点源，将计算这些景深值以及三维衍射图样中的强度分布。通常，随着照明的相干性增加（当聚光镜数值孔径接近零时），景深会增加至2倍。但是，三维点扩散函数（psf当光圈函数不均匀时，具有部分相干照明的）可能会以复杂的方式偏离到目前为止讨论的内容。在许多基于相位的，产生对比度的显微模式中，景深可能比上式预测的要深，出乎意料的浅，并且可能会产生非常薄的光学部分。
在数字和视频显微镜中，相机镜筒或ccd的物镜中的焦平面浅，在高物镜和聚光镜数值孔径下可实现的高对比度以及监视器上显示的图像的高放大倍率均有助于减小镜头的深度。领域。因此，通过视频，我们可以获得非常清晰锐利的光学切片，并且可以非常高精度地定义薄样品的焦距。